步驟二：

標準品的加樣：設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50ul,。

步驟三：

樣本孔中加入待測樣本50ul,；空白孔不加。

步驟四：

每孔加入生物素標記抗體50ul,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30分鐘；標準孔空白孔不加,。

步驟五：

棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350ul）,，靜置1分鐘,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）,。

步驟六：

除去空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100ul,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30分鐘。

步驟七：

重復(fù)步驟五

步驟八：

每孔加入底物A,、B各50ul,，37℃避光孵育15分鐘。

步驟九：

每孔加入終止液50ul,，15分鐘內(nèi)在450nm波長處測定各孔的OD值,。